禽霍亂桿菌檢測試劑盒（雙色實時熒光PCR法）說明書

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：禽霍亂桿菌檢測試劑盒（雙色實時熒光PCR法）

英文名稱：Fowl cholera Detection Kit (Dual Channel Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】25T /盒 & 50T /盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒利用實時熒光PCR原理，定性檢測禽霍亂桿菌，對禽霍亂桿菌的診斷和監(jiān)控具有重要指導(dǎo)意義。

【檢驗原理】

本試劑盒針對禽霍亂桿菌病菌基因的特定基因設(shè)計特異性引物和熒光標(biāo)記探針，利用儀器對 PCR過程中相應(yīng)通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

【主要組成成份】

注：陰性對照為滅菌純水，陽性對照為含禽霍亂桿菌靶基因的質(zhì)粒。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler 480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1. 取病死禽心血樣本，肝、脾等組織樣本。

2. 應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。

3. 標(biāo)本收集后若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標(biāo)本應(yīng)凍存于-20℃～-80℃，長期保存不會影響本試劑盒檢測結(jié)果，但有可能影響培養(yǎng)法檢測結(jié)果的準確性。

4. 標(biāo)本保存期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。

【檢驗方法】

1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。

（2）核算當(dāng)次實驗所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計算當(dāng)次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)

（3）在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

（4）蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。

2.樣本準備（樣本處理區(qū)）

用DNA/RNA提取試劑盒提取核酸即可，具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本DNA各5μl、終體積25μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4.PCR（PCR擴增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應(yīng)管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。

（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增。

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團選擇None。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。

（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。

2.標(biāo)本結(jié)果判定：

（1）陽性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。

（2）可疑：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標(biāo)本進行重復(fù)檢測，如重復(fù)實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。

（3）陰性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗結(jié)果的解釋】

【檢驗方法的局限性】

1. 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最di檢出限shi可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。

2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當(dāng)容易造成DNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最di檢出限為10³ Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤3%。

【注意事項】

1. 使用本試劑盒的實驗室，應(yīng)嚴格按照國家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理；

2. 為避免核酸降解，樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理；

3. 各區(qū)域物品均為專用，不得交叉使用，以免污染；檢測結(jié)束后，應(yīng)立即對工作臺清潔；

4. 吸取反應(yīng)液時，應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡；上 PCR 儀前，應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準確；

5. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時離心；

6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準備區(qū)，并單獨存放；

7. 為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進行任何標(biāo)記；

8. 檢測過程中使用過的吸頭，應(yīng)直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi)，檢測結(jié)束的PCR 反應(yīng)管，切忌開蓋，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄；工作臺及各種實驗用品應(yīng)定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進行消毒；

9. 儀器擴增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進行設(shè)置；不同批號試劑不能混用；并在有效期內(nèi)使用。